Kommentar zur Ph.Eur.-Methode 2.5.34.

Essigsäure in synthetischen Peptiden


Die Methode beschreibt eine Quantifizierung von Essigsäure in synthetischen Peptiden mittels Flüssigchromatorgraphie (LC)I. Sie ersetzt die zuvor in den entsprechenden Monographien beschriebenen, oft untereinander eng verwandten gaschromatographischen Methoden wie etwa im Falle von GonadorelinII, Somatostatin oder Protirelin.

Die neu etablierte HPLC-Methode zeigt eine bessere Präzision als die zuvor beschriebenen GC-Methoden. Sie stellt eine Anpassung einer bereits vorhandenen Methode zur Bestimmung von Acetat in Zelluloseacetat-butyratIII dar. In der Ph.Eur. Monographie für Gonadorelinacetat des Supplement 2000 wurde bereits eine sehr ähnliche Reverse-Phase (RP) Flüssigchromatorgraphiemethode publiziert.


Mobile Phase:

Bei den bereits erwähnten und miteinander verwandten LC-Methoden basiert die Retention des Analyten generell auf der Wechselwirkung zwischen der hydrophoben stationären Phase (Octadecylsilicagel) mit den in der mobilen Phasen wandernden EssigsäuremolekülenIV. Der pH-Wert der mobilen Phase ist bei 3,0 gepuffert. Dies ist signifikant unter dem pKa der Essigsäure (4,76V). Die Hydrophobizität der organischen Säure wird also durch die Protonierung der Carboxylat-Gruppe gesteigert, wodurch sich die Retentionszeit im Vergleich zum deprotonierten Molekül verlängert.


Im Gegensatz zu der oben erwähnten, für Gonadorelinacetat beschrieben Methode, verwendet die unter 2.5.34. aufgeführte Methode nur für die ersten 5 min einen isochratischen Modus. Danach beginnt eine Gradientenelution (Steigerung des organischen Lösungsmittelanteils in der mobilen Phase), wodurch hydrophobere Komponenten von der Säule gewaschen werden sollen.

In vielen Fällen ist dies sicher ein unverzichtbarer Schritt. Würde er nicht durchgeführt, so würden die Peptidmoleküle an der stationären Phase adsorbiert bleiben und sich auf der Säule akkumulieren. Die Folge wäre eine signifikante Beeinflussung der chromatographischen Charakteristika des Systems und damit eine Verschlechterung der Reproduzierbarkeit der Chromatographie.


Obwohl dieser zusätzliche Reinigungsschritt eine Verbesserung zu der „früheren Version“ dieser Methode darstellt, so ist vermutlich immernoch nicht garantiert, dass auch extrem hydrophobe Peptide durch die 50%ige Methanollösung ebenfalls vollständig entfernt werden. Da die Methode jedoch als eine allgemein anwendbare Methode zur Analyse des Essigsäuregehaltes in Peptiden dargestellt wird, sollte der Anwender sich dieses potentiellen Problems bewusst sein. Dies gilt vor allem, wenn die Methode für Peptide angewendet werden soll, bei denen sie nicht in einer aktuell gültigen Ph. Eur. Monographie explizit vorgeschrieben ist.


Eine höhere Methanolkonzentration für den Reinigungsschritt könnte möglicherweise in einigen speziellen Anwendungsfällen notwendig sein. Alternative zur Verwendung Methanol bietet sich unter anderem auch Acetonitril an, da es eine höhere Elutionskraft als Methanol besitzt und somit für Reinigungszwecke dieser Art unter Umständen besser geeignet erscheint. Eine generelle Substitution von Methanol durch Acetonitril in allen verwendeten mobilen Phasen würde sich ohne eine entsprechende Anpassung des Gradientenprogrammes vermutlich jedoch nicht unbedingt vorteilhaft auswirken: die Verringerung des Retentionsfaktors für das Essigsäuresignal wäre die Folge.


Stationäre Phase:

Auf der anderen Seite stellen vermutlich sehr basische Peptide ein weiteres Problem für die Lebenszeiterwartung der Säule dar, zumal die in der Methodenbeschreibung erwähnte stationäre Phase nicht „endcapped“ ist. Sehr basische Substanzen könnten daher aufgrund von elektrostatischen Wechselwirkungen an den noch verbliebenen, negativ geladenen freien Silanolgruppen des gepackten Materials haften bleiben.

Sowohl sehr hydrophile Peptide als auch andere verwandte Moleküle, die möglicherweise in der zu analysierenden Substanzprobe ebenfalls enthalten sein könnten (wie z.B. Trifluoracetat, Formiat, etc.), überlagern das Essigsäuresignal unter Umständen ganz oder teilweise. Aus diesem Grund sollte das chromatographische Auflösungsvermögen und die Selektivität des Analysensystems immer beobachtet werden und auf jede gewünschte Anwendung abgestimmt sein. Unglücklicherweise ist die Retentionszeit des Essigsäuresignals mit 3 bis 4 min bemerkenswert kurz.

Ein größere Retentionsfaktor für den Analyten bedeutet meist eine verbesserte Auflösung in der chromatogrophischen TrennungVI. Um gute Trennergebnisse zu erhalten sollten die Werte für die relevante Retentionsfaktoren üblicherweise im Bereich von 2 bis 10 liegen.

Möglicherweise führt die Verwendung von speziellem, für die Analyse von stark polaren organischen Säuren besonders geeignetem C18-Säulenmaterial („polar encapped“) zu einer Verlägerung der Retentionszeit des Analyten und somit zu einer besseren Auflösung. Zusätzlich würde „polar endcapping“ vor dem als „hydrophober Kollaps“ bekannten Effekt schützen. Dieser Effekt kann bei herkömmlichen Octadecyl-Säulen beobachtet werden, sobald sie mit wässrigen Eluenten mit nicht mehr als 5% organischen Lösungsmittelanteil betrieben werdenVII.


Weitere Chromatographiebedingungen und Systemeignungstest:

Die Temperatur beeinflusst ebenfalls die Auflösung von RP-HPLC-Trennungen. Dies triff besonders bei der Trennungen von ionischen Analyten zu. Obwohl eine Kontrolle der Säulentemperatur gemäß der Ph.Eur. Methodenbeschreibung nicht vorgeschrieben ist, so erscheint dies für die praktische Routinearbeit dennoch empfehlenswert.

Begründet durch all diese Einzelfaktoren erscheint es ebenso empfehlenswert einen Systemeignungstest bei der Anwendung durchzuführen. Die Trennsystemtauglichkeit kann so beurteilt werden, bevor die zu analysierenden Proben laufen. Eine Trennnug von eng verwandten Molekülen wie etwa Formiat, Lactat, Citrat, Propionat, Trifluoracetat und Acetat und eine anschließende Prüfung der Auflösungsfaktoren könnte hier hilfreiche Dienste leisten.


Alternative Trennmethoden:

Sofern die Methodenbeschreibung nicht uneingeschränkt übernommen werden soll oder muss, können zur Bestimmung des Essigsäuregehaltes in Peptiden ganz allgemein statt der vorliegenden Ph.Eur. HPLC-Methode auch andere Methoden ausgewählt werden. Daher hier noch eine kurzer Blick auf die sich bietenden Alternativen:

Ein vom Chromatographieprinzip her anderer Ansatz wird in der „Gonadorelin Hydrochlorid“ Monographie der 24 – NF19 Supplement 2 im Test „limit of acetate“ beschrieben. In diesem Fall wird eine Anionenaustauschersäule (quartäres Ammin, chemische gebunden an spherische Silica Kernpartikel) in Kombination mit einer schwefelsäurehaltigen, wässrigen mobilen Phase verwendet.

Eine weitere Alternative wäre die Anwendung der klassischen Ionenchromatographie (IC), die in solchen Fällen meist mit Anionenautauscherharzen auf Basis von organischen Polymeren in Verbindung mit wässrigen Natronlauge- oder Carbonatlösungen als Eluenten betrieben wird.

Ganz allgemein kann zur Bestimmung von Acetat in Peptiden auch die hydrophile Interaktionschromatographie, die Ionenpaarchromatographie, die Ionenexklusionschromatographie, die Kapillaryelectrophoresis (CE) sogar die Isotachophorese (ITP) herangezoen werden. In diesem Zusammenhang erscheinen die CE VIII, die Ionenexklusionschromatographie oder die IC die wertvollsten Alternativen zur Trennung an der reversen Phase zu sein.


Detektion und mögliche Alternativen:

Beide oben erwähnten Pharmakopoe-HPLC-Methoden (die der USP und die der PhEur) verwenden die direkte UV-Absorption bei einer recht kurzen Wellenlänge als Detektionsmethode. Die meisten kommerziell erhältlichen HPLC-Systeme werden vermutlich mit einem UV-Detektor zusammen ausgeliefert, zumal die UV-Detektion vermutlich die am häufigsten verwendete Detektionsmethode ist. Die Detektion mit Hilfe eines Brechungsindexmonitors beispielsweise wäre für eine isochratische Methode durchaus anwendbar, erscheint jedoch meist anspruchsvoller in der Handhabung und ist im Allgemeinen für Gradientenmethoden eher ungeeignet. Für die IC und die CE ist die Detektion mittels unterdrückter Leitfähigkeitsmessung durchaus üblich. Leitfähigkeitsdetektion kann vermutlich die Sensitivität im Vergleich zur UV-Detektion erhöhen. Sie führt aber ebenfalls zu einer weniger selektiven Detektion, da hiermit auch anorganische Anionen quasi „eingeblendet“ werden. Zudem scheint eine mangelnde Sensitivität der UV-Detektion in den meisten Fällen nicht das Problem zu sein. Die Detektion per UV-Absorption erscheint demnach also in den meisten Fällen die erste Wahl zu sein.


Kalibrierung:

Die Ph.Eur. Methode 2.5.34. beschreibt eine quantitative HPLC-Analyse auf Basis einer 1-Punkt-Kalibrierung. Hierbei wird eine Lösung von Eisessig in Wasser als Referenzlösung verwendet. Die oben erwähnte USP-Methode beschreibt statt dessen die Herstellung einer Lösung von Natriumacetat-trihydrat in Wasser zur Verwendung als Referenzlösung. Vom Standpunkt des Anwenders her erscheinen beide Möglichkeiten qualitativ gleichwertig zu sein. Es kann jedoch empfehlenswert sein den Gehalt des verwendeten Referenzmaterials auf einen entsprechenden international anerkannten Referenzstandard zurückführen zu können, obwohl dies weder von der USP noch von der Ph. Eur. gefordert wird.


Präzision:

Unglücklicherweise erwähnen allgemeine Ph.Eur. Methoden nie, wie viele Proben für eine Bestimmung vermessen werden sollten und wie oft (z.B.: Einzel-, Doppel- oder Trippelinjektion) jede Einzelprobe evaluiert werden sollte. Das Maß der Messunsicherheit der Ergebnisse ist demnach durch die Methodenbeschreibung nicht definiert und die Erstellung eines geeigneten Analysenprogramms ist damit vollständig dem Anwender überlassen. Sinnvollerweise sollte die Messunsicherheit der Analysenergebnisse natürlich mit der geforderten Spezifikation abgestimmt sein. In diesem Zusammenhang kann eine Betrachtung der Methodenfähigkeit gute Dienste leistenIX.

I siehe auch Ph.Eur. 2.2.29

II siehe auch 2.2.28 und Ph. Eur. Monographie für Gonadorelinacetat im Supplement 1999.

III siehe auch Ph.Eur. Monographie für Celluloseacetate-butyrate.

IV siehe auch Lloyd R. Snyder et al., "Parctical HPLC Method Development", 2nd Edition, John Wiley & Sons, 1997;
oder J.H. Knox and B Kauer, "High Performance Liquid Chromatography", R.A. Hartwick Eds., John Wiley & Sons, 1989.

V D.R. Lide Ed., "CRC Handbook of Chemistry and Physics, 80th Edition", CRC Press LLC, 1999.

VI J.W. Dolan,"Starting Out Right, Part III - The Role of the Solvent in Controlling Selectivity", LCGC 18(2), 118, 2000.

VII R.D. Morrison,J.W. Dolan, "Reversed-Phase LC in 100% Water", LCGC, 13(10), 720, 2000.

VIII K.D. Altria, "Capillary Electrophoresis in the Pharmaceutical Industry", Pharmeuropa 10(4), 524, 1998.

IX S. Kromidas;”Validierung in der Analytik”, Wiley/VCH, 2000.